Lípidos antifúngicos: el desafío de su producción en bacterias usando ingeniería genética

Andrea Viridiana Moyao Mejía y Daniel Genaro Segura González

¿Alguna vez te has cuestionado el papel que pueden desempeñar seres tan pequeños como los microorganismos en el desarrollo de productos que puedan resolver problemas concretos de nuestra sociedad? Desde la antigüedad, incluso sin saberlo, el ser humano aprendió a aprovechar microorganismos como levaduras y bacterias para obtener algunos alimentos y bebidas. Conforme el conocimiento avanzó, también se descubrió que a partir de algunos hongos se podían obtener antibióticos, e inclusive mediante ingeniería genética a partir de bacterias, se logró obtener insulina idéntica a la humana para tratar la diabetes.

En todas estas actividades está implicada la biotecnología, la cual aprovecha los sistemas biológicos u organismos para crear productos y/o mejorar procesos. ¿Y qué tienen en común la biotecnología y productos como los plásticos biodegradables, los geles y los fungicidas? Pues la respuesta es muy sencilla: una bacteria.

Azotobacter vinelandii es una bacteria aislada del suelo que resulta muy interesante para la industria al ser capaz de producir biopolímeros como el polihidroxibutirato (PHB), que se usa como plástico natural biodegradable sustituto de los plásticos derivados del petróleo, o el alginato, que es un polisacárido que se usa para hacer geles y espesantes para diferentes industrias. Además, produce unos lípidos conocidos como alquilresorcinoles (o ARs), que, aunque se descubrieron originalmente en plantas, también los producen algunos hongos, esponjas marinas y algunas bacterias. Resulta interesante que estos compuestos también se encuentran en cereales como el trigo y el centeno [1] (Figura 1).

El gran interés que existe en el estudio de los alquilresorcinoles se debe a las muchas aplicaciones industriales que éstos pueden tener

Por su estructura química, los alquilresorcinoles tienen propiedades similares a las de los fosfolípidos que se encuentran en las membranas celulares de la mayoría de los organismos que habitan nuestro planeta: una parte de la molécula es soluble en agua y otra no. En términos químicos se trata de una cadena de carbonos llamada “alquil” (la R en la Figura 1), que es hidrofóbica (o sea, que le tiene fobia al agua) y otra que es un anillo resorcinol (Figura 1) que es hidrofílico (esto es, que le “gusta” el agua). Esto les permite formar distintas estructuras membranales que resultan muy útiles en el área farmacéutica y de producción de cosméticos.

Además, estos lípidos han demostrado impedir el crecimiento de hongos que contaminan hortalizas por lo que se han incluido en distintas formulaciones fungicidas. Incluso, se han usado los ARs extraídos de centeno para formular una solución que se aplica a cultivos de manzana y evitar así el ataque de hongos patógenos como Neofabraea perennans y Penicilium expansum, que causan la pudrición de la fruta. Además, se ha demostrado que los ARs de A. vinelandii también impiden el crecimiento de hongos que atacan al mango [2 y 3] (Figura 2).

Para obtener a los ARs y usarlos para sus diferentes aplicaciones existen distintas metodologías. En una de ellas se puede realizar la extracción a partir de los cereales; aunque este proceso es costoso debido a que los ARs se encuentran en bajas concentraciones. Una alternativa es obtenerlos de cultivos de A. vinelandii, pues la cantidad de ARs que puede llegar a producir esta bacteria es mayor; la bacteria se multiplica rápidamente y, además, su producción se puede mejorar biotecnológicamente con mayor facilidad que en plantas. Lograrlo ha sido uno de los principales objetivos de nuestras investigaciones.

En el caso de los alquilresorcinoles, nuestro mayor reto fue plantear la estrategia correcta para obtener una cepa de A. vinelandii que pudiera sobreproducir estos lípidos. Por ejemplo, en su ciclo de vida esta bacteria forma quistes, que son células que ya no se multiplican y son resistentes a condiciones adversas de crecimiento. Los ARs se encuentran principalmente en la cápsula de los quistes (Figura 3), pero en cultivos de la bacteria menos del 0.1% de las células se enquista y los produce. Aunque es posible inducir el enquistamiento mediante el cambio del medio óptimo de cultivo por uno estresante, esto representa un proceso más costoso e impráctico.

¿Es posible lograr que la bacteria produzca ARs sin que se enquiste?

La respuesta es sí. Para esto se decidió abordar la estrategia de modificación genética de la producción de ARs a dos niveles:

1. La modificación de los sistemas de regulación genética que determinan en qué condiciones se producen los ARs en A. vinelandii; es decir, esta bacteria naturalmente posee una serie de proteínas que controlan la producción de ARs para sintetizar sólo las cantidades necesarias para cumplir con su función biológica en las condiciones ambientales imperantes, por lo que la inactivación de los genes que codifican esas proteínas potencialmente eliminaría las limitaciones en su producción (Figura 4).
2. La alteración del metabolismo de la bacteria para favorecer que los nutrientes se canalicen a la producción de ARs en exceso. La bacteria utiliza los nutrientes no solo para reproducirse y multiplicarse, sino también para generar otros compuestos como los polímeros PHB y alginato. Por esta razón, la eliminación de estas rutas metabólicas competidoras mediante técnicas genéticas podría también conducir a una mayor producción de ARs.

En total evaluamos 6 cepas modificadas genéticamente (mutantes) en las que se inactivaron los genes que regulan negativamente la producción de ARs, es decir, se inactivaron genes que generan moléculas que inhiben la producción de los ARs) y 5 mutantes con las vías de síntesis de PHB y de alginato inactivas. Dentro de estas, se encontró que la combinación más favorecedora fue inactivar el gen de una proteína reguladora llamada RsmA, en conjunto con la inactivación de la síntesis del alginato (gen algA), ya que, al inactivar ambos genes, la mutante presentó niveles de producción 3.6 veces mayores que los de la cepa no modificada genéticamente (llamada cepa silvestre). Sabemos que la proteína RsmA bloquea la producción de las enzimas implicadas en la síntesis de ARs (bloqueando el proceso de “traducción”, esto es, la lectura del ARN mensajero, para generar proteínas), por lo que su eliminación permitió tener una mayor cantidad de dichas enzimas y, como consecuencia, una mayor síntesis de estos lípidos.

Adicionalmente, la eliminación de la producción de alginato permitió canalizar una mayor cantidad de nutrientes (principalmente de sacarosa) hacia la síntesis de ARs, ya que el rendimiento en gramos de ARs por gramo de sacarosa consumida, fue más del doble en la mutante. Uno de los resultados más interesantes de este trabajo fue descubrir que la alta producción de ARs de la mutante se logró en células que no se están enquistando, a diferencia de lo que ocurre en la cepa silvestre. Es decir, se eliminó la necesidad de inducir el enquistamiento, lo que permite un proceso de producción más sencillo y económico.

El trabajo que hemos descrito en este artículo ilustra el gran potencial que tienen las distintas herramientas de la ingeniería genética para mejorar la producción biotecnológica de metabolitos de interés industrial. A partir de ahora trabajaremos en la utilización de los lípidos ARs en formulaciones para impedir la proliferación de hongos patógenos que infectan distintos cultivos de importancia económica.

Referencias

1. Kruk, J., Aboul-Enein, B., Bernstein, J. y Marchlewicz M. (2017). Dietary alkylresorcinols and cancer prevention: a systematic review. Eur Food Res Technol 243, 1693–1710. DOI: 10.1007/s00217-017-2890-6
2. Bolaños-Dircio, A., Segura, D., Toribio-Jimenez, J., Toledo-Hernandez, E., Ortuno-Pineda, C., Ortega-Acosta, S., Palemon-Alberto y F., Romero-Ramirez, Y. (2022). [Cysts and alkylresorcinols of Azotobacter vinelandii inhibit the growth of phytopathogenic fungi](https://doi.org/10.4067/S0718-58392022000400658). Chilean Journal of Agricultural Research, 82 (4), 658-662. DOI: 10.4067/S0718-58392022000400658
3. Tahir I., Ahmadi-Afzadi M., Nybom H. & Dey S. (2014). Rye Bran alkylresorcinols inhibit growth of Penicillium expansum and Neofabraea perennans in vitro and in vivo on different apple cultivars. Europ. J. Hort. Sci. 79(4), 218-225.